Resúmenes de los trabajos académicos de nuestros becados
2015/5/13
Factores biologicos que afectan la resucitacion y subsecuente multiplicacion de células estresadas no cultivables de Ralstonia solanacearum
Sergio Daniel Moreira Ascarrunz
Departamento de Ciencias Bioproductivas, Escuela Unida de Postgrado en Ciencias Agricolas
Universidad de Agricultura y Tecnología de Tokio, Japón
Julio de 2011
Células de Ralstonia solanacearum (raza 1 biovar 3) fueron expuestas ya sea a la privación de nutrientes, estrés por frío o cobre para inducir células no cultivables. La recuperación y subsecuente crecimiento de dichas células fueron evaluados en agua y en microcosmos de suelo pasteurizado y no tratado. La patogenicidad de las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas por frío fué también evaluada inoculando dichas células a plantas de tomate susceptibles al patógeno en experimentos en invernadero.
Las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas por frío, separadas de las células cultivables remanentes mediante diluciones fueron capaces de recuperar su capacidad de cultivo con una muy corta fase estacionaria e incrementar en número de células cultivables en agua, después de que el estrés fué neutralizado, pese a la total ausencia de fuentes externas de nutrientes. Por otro lado, en suelo, sólamente las células estresadas con frío incrementaron en células cultivables si se añadían al suelo nutrientes adicionales. El incremento de células cultivables en agua fué acompañado por un aumento en el número de copias de ADN, indicando que la multiplicación celular estaba involucrada en el incremento de la población cultivable. Ambos tipos de células estresadas no cultivables observadas bajo el microscopio electrónico de transmisión eran claramente más pequeñas o más redondas que la células frescas no estresadas. Sólamente las células estresadas con frío aumentaron de tamaño durante el aumento en número de células cultivables, sugiriendo que la privación de nutrientes es más estresante para las células que la baja temperatura. Algunas células expuestas a ambos tipos de estrés tenían flagelos visibles, 36 h después de la neutralización del estrés.
Cuando las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas con frío fueron inoculadas a un suelo de campo no pasteurizado, plantado con plántulas de tomate susceptibles, fueron capaces de causar infección a niveles comparables con células estresadas cultivables o con células frescas no estresadas a bajas concentraciones.
Cuando las células no cultivables, ya sean estresadas con frío o con calor, fueron inoculadas en agua destilada esteril con una cepa casi isogénica de R. solanacearum o una cepa de R. picketii, el incremento en número de células cultivables fué claramente inhibido. Esto sugiere que la cepa casi isogénica o la cepa estrechamente relacionada, aumentaron la competición en el microcosmos de agua, privando de los nutrientes para que las células no cultivables “resuciten” y se multipliquen. La co-inoculación con estas cepas suprimió completamente la resucitación y multiplicación celular de las células no cultivables estresadas con calor, indicando que éstas células no cultivables estaban más estresadas que los otros tipos de células no cultivables. Sin embargo, cuando las células no cultivables fueron co-inoculadas con una cepa de Pseudomonas fluorescens, su recuperación e incremento en unidades formadoras de colonias (UFC) fueron inhibidas en menor medida. La co-inoculación con una cepa de Escherichia coli O157:H7 no causó una inhibición tan evidente en el incremento de UFC en todos los tipos de inóculos estresados no cultivables. Cuando fueron inoculadas con la cepa casi isogénica de R. solanacearum o las cepas de R. pickettii, P.fluorescens o E. coli O157:H7, muertas con calor o autoclavadas, las células no cultivables incrementaron más en número de células cultivables que cuando fueron inoculadas solas en agua destilada.
La exposición de células frescas de R. solanacearum a 20 mM CuSO4 produjo células no cultivables transitorias, las cuales exhibieron una recuperación remarcable en capacidad de cultivo después de la incubación en la solución por 36 h, alcanzando una densidad cercana al nivel inicial a las 108 h. Para determinar si estas células no cultivables realmente “resucitaron” o se multiplicaron después de adaptarse a la toxicidad del Cu, se construyeron curvas de crecimiento para contrastar las tasas de incremento del número de células cultivables entre el inóculo estresado con Cu y el no estresado. Adicionalmente, células frescas no estresadas fueron expuestas a CuSO4 en la presencia de ácido nalidíxico, añadiendo el antibiótico a diferentes tiempos después del inicio del estrés por Cu para verificar cualquier multiplicación celular durante el incremento poblacional. Los resultados revelaron que las células no cultivables sobrevivientes a la toxicidad del Cu se adaptaron muy rápidamente al Cu y comenzaron a multiplicarse a las 12 h, porque sólamente las células estresadas con Cu que se incrementaban en la fase de crecimiento exponencial, y no aquellas en la fase estacionaria, fueron muertas por el antibiótico. estas células exhibieron una aparente tolerancia a este metal cuando fueron re-inoculadas a una solución fresca de CuSO4, y también detoxificaron el ión en la solución en la cual crecieron. La presencia de nutrientes contrarrestó grandemente el efecto del Cu en los microcosmos de agua, pues se detectaron células cultivables que incrementaron en número incluso cuando fueron expuestas a 40 mM CuSO4. Por el contrario, cuando fueron inoculadas a suelo no pasteurizado, las células estresadas con Cu no mostraron dichas recuperaciones. Sin embargo, cuando el suelo fué pasteurizado previamente a la inoculación o enriquecido con nutrientes, se recuperaron células cultivables y éstas incrementaron su número.
Estos resultados demuestran que las células no cultivables de R. solanacearum pueden sobrevivir utilizando su reserva celular de nutrientes asi como materiales de células muertas, y que la mayor disponibilidad de nutrientes en agua o suelo causa que las células no cultivables respondan rápidamente a estos nutrientes externos o a los exudados radiculares del huesped para reanudar su crecimiento celular y su patogenicidad.
REF: Telf: 2227855; Cel: 72512349
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Departamento de Ciencias Bioproductivas, Escuela Unida de Postgrado en Ciencias Agricolas
Universidad de Agricultura y Tecnología de Tokio, Japón
Julio de 2011
Células de Ralstonia solanacearum (raza 1 biovar 3) fueron expuestas ya sea a la privación de nutrientes, estrés por frío o cobre para inducir células no cultivables. La recuperación y subsecuente crecimiento de dichas células fueron evaluados en agua y en microcosmos de suelo pasteurizado y no tratado. La patogenicidad de las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas por frío fué también evaluada inoculando dichas células a plantas de tomate susceptibles al patógeno en experimentos en invernadero.
Las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas por frío, separadas de las células cultivables remanentes mediante diluciones fueron capaces de recuperar su capacidad de cultivo con una muy corta fase estacionaria e incrementar en número de células cultivables en agua, después de que el estrés fué neutralizado, pese a la total ausencia de fuentes externas de nutrientes. Por otro lado, en suelo, sólamente las células estresadas con frío incrementaron en células cultivables si se añadían al suelo nutrientes adicionales. El incremento de células cultivables en agua fué acompañado por un aumento en el número de copias de ADN, indicando que la multiplicación celular estaba involucrada en el incremento de la población cultivable. Ambos tipos de células estresadas no cultivables observadas bajo el microscopio electrónico de transmisión eran claramente más pequeñas o más redondas que la células frescas no estresadas. Sólamente las células estresadas con frío aumentaron de tamaño durante el aumento en número de células cultivables, sugiriendo que la privación de nutrientes es más estresante para las células que la baja temperatura. Algunas células expuestas a ambos tipos de estrés tenían flagelos visibles, 36 h después de la neutralización del estrés.
Cuando las células no cultivables privadas de nutrientes y estresadas con frío fueron inoculadas a un suelo de campo no pasteurizado, plantado con plántulas de tomate susceptibles, fueron capaces de causar infección a niveles comparables con células estresadas cultivables o con células frescas no estresadas a bajas concentraciones.
Cuando las células no cultivables, ya sean estresadas con frío o con calor, fueron inoculadas en agua destilada esteril con una cepa casi isogénica de R. solanacearum o una cepa de R. picketii, el incremento en número de células cultivables fué claramente inhibido. Esto sugiere que la cepa casi isogénica o la cepa estrechamente relacionada, aumentaron la competición en el microcosmos de agua, privando de los nutrientes para que las células no cultivables “resuciten” y se multipliquen. La co-inoculación con estas cepas suprimió completamente la resucitación y multiplicación celular de las células no cultivables estresadas con calor, indicando que éstas células no cultivables estaban más estresadas que los otros tipos de células no cultivables. Sin embargo, cuando las células no cultivables fueron co-inoculadas con una cepa de Pseudomonas fluorescens, su recuperación e incremento en unidades formadoras de colonias (UFC) fueron inhibidas en menor medida. La co-inoculación con una cepa de Escherichia coli O157:H7 no causó una inhibición tan evidente en el incremento de UFC en todos los tipos de inóculos estresados no cultivables. Cuando fueron inoculadas con la cepa casi isogénica de R. solanacearum o las cepas de R. pickettii, P.fluorescens o E. coli O157:H7, muertas con calor o autoclavadas, las células no cultivables incrementaron más en número de células cultivables que cuando fueron inoculadas solas en agua destilada.
La exposición de células frescas de R. solanacearum a 20 mM CuSO4 produjo células no cultivables transitorias, las cuales exhibieron una recuperación remarcable en capacidad de cultivo después de la incubación en la solución por 36 h, alcanzando una densidad cercana al nivel inicial a las 108 h. Para determinar si estas células no cultivables realmente “resucitaron” o se multiplicaron después de adaptarse a la toxicidad del Cu, se construyeron curvas de crecimiento para contrastar las tasas de incremento del número de células cultivables entre el inóculo estresado con Cu y el no estresado. Adicionalmente, células frescas no estresadas fueron expuestas a CuSO4 en la presencia de ácido nalidíxico, añadiendo el antibiótico a diferentes tiempos después del inicio del estrés por Cu para verificar cualquier multiplicación celular durante el incremento poblacional. Los resultados revelaron que las células no cultivables sobrevivientes a la toxicidad del Cu se adaptaron muy rápidamente al Cu y comenzaron a multiplicarse a las 12 h, porque sólamente las células estresadas con Cu que se incrementaban en la fase de crecimiento exponencial, y no aquellas en la fase estacionaria, fueron muertas por el antibiótico. estas células exhibieron una aparente tolerancia a este metal cuando fueron re-inoculadas a una solución fresca de CuSO4, y también detoxificaron el ión en la solución en la cual crecieron. La presencia de nutrientes contrarrestó grandemente el efecto del Cu en los microcosmos de agua, pues se detectaron células cultivables que incrementaron en número incluso cuando fueron expuestas a 40 mM CuSO4. Por el contrario, cuando fueron inoculadas a suelo no pasteurizado, las células estresadas con Cu no mostraron dichas recuperaciones. Sin embargo, cuando el suelo fué pasteurizado previamente a la inoculación o enriquecido con nutrientes, se recuperaron células cultivables y éstas incrementaron su número.
Estos resultados demuestran que las células no cultivables de R. solanacearum pueden sobrevivir utilizando su reserva celular de nutrientes asi como materiales de células muertas, y que la mayor disponibilidad de nutrientes en agua o suelo causa que las células no cultivables respondan rápidamente a estos nutrientes externos o a los exudados radiculares del huesped para reanudar su crecimiento celular y su patogenicidad.
REF: Telf: 2227855; Cel: 72512349
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